研究背景介绍
l前列腺癌(PCa)是成年男性中非常普遍的非皮肤恶性肿瘤。PCa是西方国家男性癌症相关死亡的第二大原因。西方发达国家的PCa发病率逐渐稳定，随后随着时间的推移而下降。包括中国在内的发展中国家的PCa发病率呈稳步增长趋势。由于缺乏早期检测PCa的生物标志物，诊断和过度治疗是PCa治疗中出现的问题。
l微阵列技术在转录组学方面取得了相当大的进展，提供了更全面和更精确的转录模式的观点肿瘤。将生物信息学应用于微阵列表达谱可以增强潜在特异性标记的优化。例如，已经确定了与人类癌症进展相关的血管壁蛋白家族中的蛋白质。血管壁蛋白家族成员PANX2的表达水平与肾细胞癌(RCC)的存活率差有关，并促进了RCC细胞的增殖，这表明PANX2可能是RCC预后的有价值的生物标志物。
l很少有研究探讨PANX2在PCa中的临床价值和潜在机制。铁死亡是细胞死亡的一种铁依赖性形式，这一特征将其与凋亡、自噬和坏死区分开来。铁死亡导致三价铁的积累和脂质过氧化。诱导铁死亡有助于选择性清除多种肿瘤细胞，是一种新兴策略。最近在某些癌细胞中发现了几种铁死亡调节剂。例如，Nrf2是防止铁死亡的氧化应激反应的关键基因。谷胱甘肽过氧化物酶-4(GPX4)是哺乳动物中硒依赖性谷胱甘肽过氧化物酶的独特成员，已被证明在铁死亡细胞死亡期间抑制脂质ROS产生中起着关键作用。然而，铁死亡的潜在调节机制仍不确定。作者目前的研究表明，PANX2作为一种潜在的标记物，可以通过Nrf2信号通路调节PCa细胞的增殖、迁移、侵袭和铁沉积。
l总的来说，结合生物信息学和体外分析比仅应用生物信息学更有效，这可能有助于PCa诊断和治疗的进步。
研究流程
结果解读
1.DEGss的识别
l使用“Limma”R包分析从GSE(n=21)和GSE(n=50)数据集获得图谱上的差异表达基因(DEGss)(表1)。
l基于p值0.05和
Log2(折叠变化)
0.7的参数集，在GSE数据集中的13个PCa和8个正常样本中鉴定出个DEGss，其中个上调基因和个下调基因(图1A和B)。在GSE数据集中的36个PCa和14个正常样本中，共鉴定出个DEGs，其中有个上调基因和个下调基因(图1C和D)。
l主成分分析(PCa)显示，在GSE数据集中，PCA和正常样本完全被DEGss分开(图1E)。这意味着DEGss的表达模式是一种独特的特征，可用于区分PCa和正常样品。主成分分析在GSE数据集中也显示了类似的结果(图1F)。
表1
主成分分析微阵列表达谱的获得。
图1
图PCa中来自GSE和GSE数据集的上调和下调DEGss的分布。
(A，C)DEGss火山图。在火山图中，每个点代表一个基因，绿点代表在p0.,value0.05,红点表示p0.，黑点表示p0.01。
(B、D)DEGss的层次聚类。输入数据是PCa强度相对于正常强度的以2为底的对数比。红色表示PCa中上调的基因；蓝色表示下调基因。
(E、F)用主成分分析法对主成分分析细胞和正常样本进行分离。
2.DEGss的富集分析
l作者选择了GSE和GSE数据集之间常见的个deg进行进一步分析(图2A)。“clusterProfiler”R包用于基因功能富集分析，以增强作者对个常见基因的功能的理解。
l在生物过程(BP)中富集DEGs，如‘核糖体生物发生’，rRNA代谢过程’，以及‘核糖体大亚基生物发生’来分析GO。GO细胞成分(CC)术语表明DEGs富含“核糖体”、“核糖体亚单位”和“线粒体基质”。
l此外，GO的分子功能术语表明DEGs富含“催化活性”、“核糖体结构成分”和“连接酶活性”(图2B)。列出了KEGG的十个最重要的途径，如“核糖体”、“河马信号通路”和“氧化应激”(图2C)。
l使用“clusterProfiler”R包建立了不同信号通路中的网络相互作用。与海马信号通路、药物代谢、谷胱甘肽代谢和铂类药物抗性相关的氧化应激表现出相互作用的关系(图2D)。
l此外，作者确定PANX2对氧化应激具有富集作用；21个基因(即FGF1、PARD6G和CCND2)被富集到河马信号通路(图2E)。
图2
两个基因芯片表达谱之间常见基因的功能富集。
(A)显示GSE和GSE的交点。
(B)表现出显著的GO富集结果。
(C)显示发生显著变化的路径。
(D)显著变化的路径被连接起来以显示它们的相互作用。在这个网络中，圆的大小与加权连通度成正比。
(E)显著改变的途径和DEGs之间的关联。圆圈大小代表基因和途径之间的连接数量。
(F)从PPI网络中获得的五个最重要的模块。红色节点表示上调基因，绿色节点表示下调基因。节点的大小与加权连接度成正比。
3.PPI网络的模块筛选
l作者基于个基因构建了一个蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络，使用聚类1从多个策略中挖掘核心基因。
l作者的筛选显示了五个关键基因模块(图2F)，从中鉴定出五个中心基因，包括PLEKHF2、PANX2、CRMP1、NDEL1和CREB3。此外，PANX2在PCa和正常样品之间表现出最显著的差异表达。
l蛋白质相互作用模型分析显示PANX2可能在蛋白质相互作用中起关键作用。因此，选择PANX2进行后续实验验证。
4.PCa细胞系候选基因的验证
l在GSE(n=21)、GSE(n=50)和TCGAPCaRNA-Seq数据集(n=)中查询PANX2，以进一步检测其在PCa细胞系中的表达。结果显示显著高水平的PANX2表达(分别为4.2E-02、1.8E-02和7.3E-11)(图3A–C)。
l此外，还对TCGA数据集(n=)中PANX2的表达与多种PCa格里森评分之间的相关性进行了分析。分析显示PANX2的差异表达与格里森评分显著相关(p0.0)(图3D)。
l总的核糖核酸和蛋白质随后从氩阳性的低环磷酸腺苷、氩阴性的Du和PC3细胞系中提取，用于定量逆转录聚合酶链反应和蛋白质印迹。相对于非致瘤性永生人类前列腺上皮细胞(RWPE1)，PANX2在PC3、DU和LNCaP细胞系中的表达显著上调(图3E和F)。结果表明PANX2可能在PCa的进展中起重要作用。基于蛋白质印迹和定量逆转录聚合酶链反应分析，PANX2在PC3细胞中高度表达。因此，PC3细胞被用于随后的细胞分析。
图3
公共数据集和细胞系中PANX2表达的验证。
(A–C)PANx2表达水平显示在GSE(n=21)、GSE(n=50)和TCGAPCa数据(n=)中。
(D)差异表达的PANX2与PCa格里森评分相关(p0.0)。
(E、F）用定量逆转录聚合酶链反应和蛋白质印迹法检测几种PCa细胞系中PANX2的表达水平。
(F、H)干扰PC3细胞系中基因和蛋白质水平的PANX2表达的效果。
(I)进行CCK-8分析以评估干扰PANX2表达后的细胞增殖活力。
5.PANX2的阻断表达抑制PCa细胞的恶性表型
l为了阐明PANX2在前列腺癌进展中的生物学功能，PC3细胞被慢病毒介导的PANX2shRNAs感染。三种不同的shRNA被设计为靶向PANX2外显子上的不同位点。
lshNC组感染sh-PANX2#1、shPANX2#2和sh-PANX2#3的PC3细胞中PANX2的mRNA水平显著低于对照组，表明PANX2已被成功敲除(图3G和H)。选择效率最高的sh-PANX2进行后续实验。PANX2-shRNA组比NC-siRNA组PC3细胞增殖明显降低(图3I)。
l此外，PANX2被敲除的细胞比NC-siRNA组的细胞具有更低的迁移和侵袭能力(图4)。作者的结果证实了PANX2是PCa细胞转移和侵袭能力所必需的。
图4
PANX2表达改变对PCa细胞恶性表型的影响
(A,B)测量伤口愈合能力。检查不同处理下的细胞迁移到伤口区域并拍照。
(C,D)ranswell迁移入侵试验。不同处理下PC3细胞侵袭和迁移能力的评价。
6.PANX2沉默可促进PCa细胞铁死亡
l作者通过干扰PANX2表达，评估铁死亡相关指标，包括铁和脂质过氧化积累，以确定PANX2是否与PCa细胞铁死亡相关。
l作者研究了PANX2对Fe2+水平变化的影响，因为亚铁(Fe2+)是启动铁死亡的必要元素。敲低PANX2会增加细胞内Fe2+的水平(图5A)。
l此外，MDA是脂质过氧化的一个代表最终产物，作者测试了PANX2是否能调节MDA在PCa细胞中的积累。抑制PANX2增加了PC3细胞株中MDA的积累(图5B)。作者的研究结果表明PANX2是铁死亡的调节因子，它调节细胞内的Fe2+和MDA。
图5
PANX2表达改变对PCa细胞铁死亡的影响。
(A,B)si-PANX2转染PCa细胞后亚铁和MDA水平的检测。
7.PANX2沉默抑制Nrf2信号通路
l作者重点研究了PANX2的功能富集结果，以建立PANX2在PCa进展中的潜在机制。
lPANX2与氧化应激相关(图6A)。Nrf2通路在氧化应激中起着至关重要的作用，尤其是Nrf2基因。
l作者还发现敲除PANX2可以显著降低Nrf2基因和蛋白质的表达，以及下游基因的表达(HO-1和FTH1)(图6B和C)。
l此外,不同浓度的Nrf2活化剂,oltipraz筛选确定激活Nrf2抑制性通路导致变化的影响推倒PANX2PCa细胞(图6d和E)。
l作者随后使用50μMoltipraz在敲除PANX2后处理PC3细胞系。与oltipraz共孵育后，对增殖、转移、侵袭和铁死亡的抑制作用完全逆转PANX2下调(图3H、4和5)。Nrf2通路成员的表达水平也升高(Nrf2、HO-1和fth1)(图6C)。这间接证明了PANX2通过Nrf2通路调控PCa细胞的生物学行为和铁死亡。
图6
Nrf2信号通路的分析。
(A)热图，表明相关路径和相应DEGs之间的关系。
(B)用定量逆转录聚合酶链反应检测转染si-PANX2或si-NC的PC3细胞系中Nrf2的表达水平。
(C)蛋白质印迹图像分析表明沉默PANX2后Nrf2及其下游成员(HO-1和FTH1)的表达水平降低。
(D、E)选择最佳浓度的oltipraz。
研究讨论
lPANX2，一个新的候选基因被筛选出来，以揭示其在PCa细胞增殖、迁移、侵袭、铁死亡和潜在机制中的重要作用。
l这项研究提供了重要的证据，证明Nrf2可以通过Nrf2信号通路调节PCa细胞的铁死亡。几项研究证明，属于血管壁蛋白家族的蛋白质在人类癌症中起着至关重要的作用。最近的研究表明，在肾细胞癌和胆管癌中PANX2的表达水平显著上调，但在胶质瘤中下调。这表明PANX2对不同类型的肿瘤有不同的影响。然而，PANX2在PCa中的生物学功能尚不清楚。
l在作者的研究中，作者首先证实了PANX2的表达水平在PCa组织和细胞系中显著上调。为了阐明PAN2在前列腺癌中的临床作用，作者确定PANX2的差异表达与格里森评分显著相关。PANX2被认为是PCa患者严重程度的独立因素。因此，PANX2可作为前列腺癌患者的特异性标志物。
l然而，目前的研究是一项回顾性分析，应通过招募独立的队列进行进一步的研究，以验证PANX2在前列腺癌中的临床意义。来自先前研究的越来越多的证据表明，Nrf2已被认为是肿瘤发生中氧化应激的关键基因。最近的研究表明，Nrf2的沉默表达抑制了前列腺癌的发展，这意味着Nrf2通过激活其在PCa进展中的下游靶点而发挥促癌作用。
l生物信息学和体外分析在作者研究中的应用证实了PANX2被富集到氧化应激，阻断PANX2的表达抑制了PCa细胞的增殖、迁移和侵袭，并增加了亚铁和丙二醛水平。Nrf2的激活由于在PCa细胞中过度表达PANX2而导致的PCa可能会启动抗氧化反应元件，从而阻止铁死亡并导致PCa细胞的增殖、迁移和侵袭。
l作者打算进行进一步的研究，以确定Nrf2在体内存在PANX2的情况下的作用。这是第一项证明PANX2促进增殖、迁移和侵袭，并在体外抑制PCa细胞中铁死亡的研究。这阐明了PANX2在PCa发展中的关键作用。Nrf2是前列腺癌中PANX2的靶因子，可能是一个有趣的治疗靶点。27值得注意的是，靶向失调的PANX2预计是一种耐受性良好的治疗方法。
l作者的结果表明，抑制PANX2作为Nrf2的调节因子可能是治疗PCa的一种治疗方法。然而，必须在体内验证这种疗法，并将其用于PCa的治疗。
研究总结
l总之，目前的研究结果已经成功地从不同的PCa数据集鉴定了DEGs，并选择了一个显著上调的候选基因PANX2，该基因通过Nrf2信号通路参与PCa细胞的铁死亡。作者的研究为揭示PCa进展的新机制提供了一个有价值的途径。
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